CRISPR大危机？Nature子刊确认小鼠体内出现数百种意料外的脱靶突变

药明康德/报道

毫无疑问，CRISPR基因编辑技术是近年来生物学领域最为火热的技术之一。2015年，它曾被《科学》杂志评为“年度科学突破”，相关应用也曾入选2014与2016年的《麻省理工科技评论》“年度十大科技突破”。人们相信，一个属于CRISPR的时代已经来临。

▲CRISPR技术曾被《科学》杂志评为“年度科学突破”（图片来源：《科学》）

然而，今日在《自然》子刊《Nature Methods》上发表的一篇只有1页出头的论文却发现，在小鼠的体内实验中，CRISPR技术会引入数百种意料外的基因突变。这则爆炸性的研究迅速成为了生物圈关注的热点。

要看懂这项研究，我们先来了解下CRISPR-Cas9基因编辑技术的原理。这套系统由两个关键成员组成——负责识别基因组中特定序列的“向导RNA”（sgRNA），以及负责剪切的Cas9蛋白。理论上说，通过更改向导RNA的序列，这套CRISPR-Cas9系统能够定位到基因组的任意一个位置，实行剪切与编辑。然而，基因组中过于接近的序列（高同源性）并不少见，一旦充当向导的RNA“看走了眼”，就会把Cas9蛋白带到预料外的地方进行剪切与编辑，带来潜在的风险。这一现象也被称为“脱靶效应”。

▲人们一度相信，CRISPR的脱靶效应，仅仅和互补序列（图中红色）的同源性相关（图片来源：《自然》）

对于这一现象，先前的科学家相信他们早已找到了解决之道——提前找到基因组中序列接近的同源区域不就得了？利用计算机算法，他们可以很快地找出基因组里最容易受“脱靶效应”影响的区域，这能带来两个好处：首先，在设计向导RNA的时候，科学家们可以选择最不容易产生“脱靶”的序列；其次，在CRISPR完成基因编辑后，科学家们可以反过来去检验，这些区域里是否出现了脱靶效应。如果没有，则说明这次基因编辑非常精准。

看起来很完美，不是吗？

错了！隐患依旧存在。

“在细胞系与培养皿中的组织里使用CRISPR后，这些预测性的算法能干得很棒，”本项研究的负责人之一，爱荷华大学（University of Iowa）的Alexander Bassuk教授说道：“但我们从来没有在活体的动物中，利用全基因组测序的方式去评估脱靶效应。”

▲该研究的主要负责人之一，爱荷华大学的Alexander Bassuk教授（图片来源：爱荷华大学）

真金不怕火炼。如果我们真的能完美预测CRISPR基因编辑带来的脱靶效应，那么即便是使用了全基因组测序，得到的实际结果也应该与计算机算法所预测的相差不远。为了验证这一想法，研究人员首先在细胞系中测试了四种不同的sgRNA，并挑选了活性最高的一种，用于修复小鼠体内的基因突变。后续研究也确认，这些小鼠体内的突变基因的确得到了修复。

然而，在对两只接受CRISPR基因编辑的小鼠，以及一只未接受编辑的小鼠（对照组）进行全基因组测序后，研究人员观察到了比预计高出许多的基因突变！

在第一只小鼠中，研究人员找到了164种插入/缺失突变（indels），以及1736种单核苷酸突变（SNVs）。在第二只小鼠中，同样出现了128种插入/缺失突变，以及1696种单核苷酸突变。相比之下，对照组带有的自发突变只有3-4种插入/缺失突变，以及90-100种单核苷酸突变。经过CRISPR编辑的小鼠，突变数上升了一个数量级！

▲两只小鼠（F03与F05）分别出现了大量基因突变，且有68%的突变为两者所共有（最右一列）（图片来源：《Nature Methods》）

令人惊讶的是，在这两只小鼠的大量突变中，有117种插入/缺失突变，以及1397种单核苷酸突变是两者共有的，占到了总突变数的68%有余。换句话说，这些突变并不是随机产生的。

更令人诧异的是，这些突变的基因组序列与sgRNA的序列之间，同源性并不高。

▲让人惊讶的是，最常出现突变的序列，与sgRNA序列的同源性并不高（图片来源：《Nature Methods》）

另一个不幸的消息是，这些突变大约一半和已知基因相关。它们可能会影响蛋白编码、基因转录、或是基因调控。

“没有使用全基因组测序来寻找脱靶效应的研究人员可能会错过一些关键的突变。要知道，一个核苷酸的变化就可能带来巨大的影响，”该研究的作者之一，哥伦比亚大学医学中心（Columbia University Medical Center）的Stephen Tsang教授说道：“我们相信，科学界有必要了解所有由CRISPR带来的脱靶突变，这包括了单个核苷酸的突变，以及在基因组非编码区的突变。”

▲本文作者之一Stephen Tsang教授认为全基因组测序在评估CRISPR的脱靶效应中应起到重要作用（图片来源：Columbia Ophthalmology）

研究人员指出，这项研究表明sgRNA会在目标序列之外，独立地结合其他基因组位点，带来新的突变，而这一点“令人担忧”。尽管这些接受基因编辑的小鼠目前看来一切正常，但不能排除将来出现问题的可能。

目前，研究人员还不清楚造成这一问题的关键。改善sgRNA的设计也许能规避这一问题，又或许这是sgRNA带来的通病，无法完全避免。无论如何，研究人员相信，进一步改善CRISPR-Cas9的精准度依旧有着必要，并能够回答更多的问题。而在风险未明的当下，在使用CRISPR基因编辑技术，尤其是在临床的应用中，研究人员呼吁，我们需要像全基因组测序这样的全面手段，来完整评估脱靶效应造成的影响。

点击“阅读原文”，即可访问原始论文页面。

参考资料：

[1] Unexpected mutations after CRISPR– Cas9 editing in vivo

[2] CRISPR gene editing can cause hundreds of unintended mutations

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